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更新時間：2024-05-14
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利用形態(tài)測量學(xué)來確定細(xì)胞形態(tài)的變化，可以被視為篩選潛在藥物和有毒物質(zhì)的一種令人興奮的工具，可以區(qū)分兩種主要的細(xì)胞死亡模式。
在細(xì)胞凋亡和壞死過程中，治療的早期階段會發(fā)生劇烈的細(xì)胞體積變化。從生物物理學(xué)和治療學(xué)的角度來看，區(qū)分這些過程非常重要。細(xì)胞凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡過程，而壞死則是由于環(huán)境干擾而導(dǎo)致的意外死亡。當(dāng)治療引起細(xì)胞凋亡而非壞死時，往往會有更好的結(jié)果。此外，細(xì)胞增殖過程會導(dǎo)致細(xì)胞體積的變化，作為細(xì)胞生長的一個衡量標(biāo)準(zhǔn)。
在這項研究中，我們展示了非侵入性的形態(tài)表面分析技術(shù)與經(jīng)過良好評估的生化方法相匹配，能夠清晰區(qū)分生理細(xì)胞和病理細(xì)胞。簡而言之，形態(tài)測量分析可以通過適當(dāng)?shù)募{米顆粒（NPs）誘導(dǎo)的細(xì)胞體積變化作為增殖和細(xì)胞死亡的前兆，與傳統(tǒng)方法測量的細(xì)胞存活反應(yīng)相兼容。
這個項目本質(zhì)上是跨學(xué)科的，因為它需要對不同材料及其與感興趣的生物實體的相互作用進行表征，正如團隊成員具有不同背景所示。由Ferrari博士領(lǐng)導(dǎo)的小組旨在研究液體-固體界面上兩親分子的潤濕過程、吸附和聚集，制備高度抗液體潤濕的涂層，并利用AFM和3D形態(tài)測量技術(shù)進行表征。由Morán博士領(lǐng)導(dǎo)的小組專注于控制釋放系統(tǒng)的開發(fā)以及其在2D（體積和底物）和3D條件下的體外表征。
使用S neox 3D輪廓儀是因為它具有分析大面積和從掃描中獲取重要表面參數(shù)的能力。采用了ISO 25178標(biāo)準(zhǔn)對表面進行了形態(tài)測量的表征，該標(biāo)準(zhǔn)提供了對表面紋理進行三維參數(shù)評估的規(guī)則。
在Confocal模式下，對包含在研究條件下的細(xì)胞的個體蓋玻片的整個表面進行了分析。選擇了特定區(qū)域的細(xì)胞，并使用SensoSCAN S neox軟件分析了高度（H）和長度（L）上的相應(yīng)剖面。相應(yīng)的形狀因子（SP）是根據(jù)H/L值確定的。
光學(xué)掃描形貌測量技術(shù)相對于原子力顯微鏡（AFM）具有多重優(yōu)勢：非侵入性和非破壞性的表征，以及能夠分析較大表面而不受限于幾平方厘米。此外，與AFM技術(shù)的已有經(jīng)驗相比，測量時間也減少了[2, 3]，使光學(xué)形貌測量成為一種在納微尺度上提供更高分辨率的顯微技術(shù)，提供更多定性和定量信息。盡管對于這種技術(shù)不需要熒光蛋白標(biāo)記物或光學(xué)活性染料，但共焦和干涉模式下的三維掃描形貌測量可以在細(xì)胞幾何參數(shù)評估方面提供高準(zhǔn)確性（圖1a）。因此，標(biāo)準(zhǔn)條件下的3T3纖維母細(xì)胞顯示出典型的雙極或多極結(jié)構(gòu)，呈細(xì)長形狀。此外，類似上皮細(xì)胞的HaCaT、HeLa和A431細(xì)胞呈多邊形形狀，尺寸更加規(guī)則，以離散斑塊的形式生長。由于納米粒子處理，3T3纖維母細(xì)胞呈橢圓形狀，沒有須突。上皮細(xì)胞之間邊界喪失，形狀不規(guī)則。
通過對得到的剖面進行分析（圖1b），從定量的角度評估了幾個結(jié)構(gòu)參數(shù)，例如對照細(xì)胞的高度和長度，以及經(jīng)過增殖和細(xì)胞毒性誘導(dǎo)處理的細(xì)胞。
細(xì)胞形態(tài)及其形狀因子在不同H/L比值下的變化總結(jié)如圖2a和圖2b所示。通過使用球冠模型作為細(xì)胞的幾何近似[5]，估算了細(xì)胞的體積（圖2c）。所得數(shù)值與直接使用SensoSCAN S neox軟件測量的細(xì)胞邊緣考慮在內(nèi)的數(shù)值相吻合（在所有情況下差異低于5%）。
圖2：共聚焦模式下的三維表面形貌圖像（20倍放大）和形態(tài)參數(shù)（L：長度和H：高度）（a），形狀因子（H/L比值）數(shù)值（b），以及根據(jù)光學(xué)表面形貌剖面數(shù)據(jù)和使用球冠模型作為細(xì)胞的幾何近似所估算的細(xì)胞體積。結(jié)果表示為十個獨立細(xì)胞的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。*p<0.001表示與對照細(xì)胞存在顯著差異，*p<0.001表示相同細(xì)胞系的不同處理之間存在顯著差異，≠p<0.001表示相同處理下不同細(xì)胞系之間存在顯著差異。（“3D profilometry and cell viability studies for drug response screening" by M. C. Morán, F. Cirisano and M. Ferrari is licensed under CCC）。
利用光學(xué)表面形貌測量，對細(xì)胞形態(tài)進行了分析，并且具有與MTT細(xì)胞存活檢測等常規(guī)方法相兼容的響應(yīng)時間[6]。然而，這些分析可以避免由于MTT作用而導(dǎo)致的代謝活性變化而不改變可存活細(xì)胞數(shù)量的一些矛盾結(jié)果。此外，細(xì)胞存活率的測量結(jié)果來自每毫升104-105個細(xì)胞的代謝活性的算術(shù)平均值。這么多的細(xì)胞數(shù)量可能會阻礙對細(xì)胞形態(tài)變化在非常早期階段或細(xì)胞群體中的小部分的確定。
通過三維表面形貌測量確定單個細(xì)胞的體積是建立細(xì)胞死亡模式或機制的附加價值，這是其他技術(shù)（平方厘米級別）無法簡單檢測到的。這項技術(shù)可以被視為在篩選潛在藥物和毒性材料時觀察細(xì)胞形態(tài)變化的有趣工具，特別是在治療過程中非常短的時間內(nèi)，對細(xì)胞死亡的兩種主要模式進行區(qū)分，以提前預(yù)測治療藥物的成功預(yù)期。
生物醫(yī)學(xué)研究的成功在于將納米材料應(yīng)用于疾病治療并開發(fā)用于診斷的工具。在這項工作中，3D光學(xué)表面形貌測量通過定性和定量分析，滿足了作為潛在治療或毒性藥物傳遞系統(tǒng)篩選工具的要求，促進細(xì)胞生長或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。這項工作是研究團隊**結(jié)合這兩個學(xué)科（治療和診斷）進行的發(fā)表。
Sensofar的光柵投影技術(shù)能夠有效地分析微觀尺度上的功能紋理。因此，我們可以通過快速和非破壞性的測量獲得確保功能紋理正常工作的結(jié)果。
借助S wide，我們可以通過SensoVIEW添加有關(guān)幾何形狀的所有詳細(xì)信息，并在報告中進行總結(jié)，從而提供出色的質(zhì)量控制。S wide還能克服一些典型的光柵投影系統(tǒng)的限制，因為我們可以測量拋光表面。
參考文獻(xiàn)
[1] M. C. Morán, F. Cirisano, M. Ferrari. 3D profilometry and cell viability studies for drug response screening. Mat. Sci. Eng. C. 115(2020) 111142
[2] E. Guzmán, L. Liggieri, E. Santini, M.Ferrari, F. Ravera, F. Mixed DPPCcholesterol Langmuir monolayers in presence of hydrophilic silica nanoparticles. Colloids Surf B. Biointerfaces. 105 (2013) 284-293.
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[4] M.C. Morán, J. Carazo, M.A. Busquets.Dual responsive gelatin-based nanoparticles for enhanced 5-fluorouracil efficiency. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 172 (2018) 646-654.
[5] J.A. Hessler, A. Budor, K. Putchakayala, A. Mecke, D. Rieger, M.M B. Holl, B.G.Orr,A. Bielinska, J. Beals, J.J. Baker. Atomic force microscopy study of early morphological changes during apoptosis. Langmuir 21 (2005) 9280-9286.
[6] T. Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65 (1983) 55-63.
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